Публикации 29.04.2013

29.04.2013 АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В РЕАЛИЗАЦИИ СТРЕСС-РЕАКЦИИ, С СУИЦИДАЛЬНЫМ ПОВЕДЕНИЕМ

29.04.2013 Артроскопическая пластика передней крестообразной связки коленного сустава аугментированным Hamstring трансплантатом

29.04.2013 Развитие “образа Я” современных подростков

29.04.2013 Активная визуализационная поляриметрия в видимом диапазоне длин волн

29.04.2013 Особенности физического развития детей первых трех лет жизни

29.04.2013 Экологическое значение ходов обыкновенного крота (Talpa europaea L., 1758) в формировании фаунистических комплексов в лесной зоне Западной Сибири

29.04.2013 Оптимизация рекреационного лесопользования на Уфимском плато

29.04.2013 Повышение эффективности информационно-измерительных и управляющих систем робототехнических транспортных установок

29.04.2013 Подданные стран-участниц Четверного Союза в Саратовском Поволжье (1914-1922)

29.04.2013 Участие специалиста в досудебных стадиях уголовного судопроизводства

29.04.2013 ИНДИВИДУАЛЬНО-ПСИХОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ВЫБОРА ПРОФЕССИИ В ПОДРОСТКОВОМ И ЮНОШЕСКОМ ВОЗРАСТЕ

29.04.2013 Фотохимические превращения катион-радикалов малых гетероциклов (метилоксираны, азетидин)

29.04.2013 Снижение потерь электроэнергии в трансформаторах распределительных сетей внутренним симметрированием их нагрузок

Другие разделы


Моделирование конформационного равновесия и сольватации при связывании органических соединений с биологическими мишенями

Автор Зейфман Алексей Александрович, 29.04.2013

Страницы: 1  2 

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского

Российской академии наук

на правах рукописи

Зейфман Алексей Александрович

Моделирование конформационного равновесия и сольватации при связывании органических соединений с

биологическими мишенями

02.00.03 – Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва-2013

Работа выполнена в Учебно-научном отделе №58 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии им. Н.Д. Зелинского

Российской академии наук

Научный руководитель Чилов Гермес Григорьевич

кандидат химических наук

Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского

Российской академии наук

Московский государственный университет им.

Защита состоится 11 июня 2013 г. в 15.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 02.222.01 при Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, Ленинский пр-т, д. 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук.

Автореферат разослан 8 мая 2013 г.

доктор химических наук Родиновская Л.А.

Актуальность темы. Основной парадигмой современного дизайна лекарственых средств является направленное воздействие на определённую биологическую мишень в организме человека. Крайне актуальной и до конца не решённой проблмой остаётся моделирование связывания лигандов с белковыми мишенями извесной структуры. На сегодняшний день наиболее точным методом расчёта прочности связывания лигандов с терапевтическими мишенями является метод возмущения свободной энергии (ВСЭ), основанный на молекулярно-механическом описании полноатомной системы белок-лиганд с явным учётом молекул растворителя. Данный подход является наиболее эффективным вычислительным методом оптимизации лкарственных кандидатов, поскольку позволяет учесть ряд факторов (например, пдвижность белка, конформационное равновесие лиганда и сольватацию системы), которые игнорируются в методах QSAR и молекулярного докинга, но зачастую определяют различие в связывании близких по структуре соединений.

Точность метода ВСЭ определяется корректностью молекулярнмеханического силового поля и качеством сэмплирования системы. Предметом иследования настоящей работы являлись подходы к улучшению сэмплирования при использовании стандартных параметров силового поля.

Проблема недостаточного сэмплирования чаще всего возникает при моделирвании комплекса органического вещества с терапевтической мишенью. Важную роль в динамике этой системы играют молекулы воды, контактирующие с атомами белка и лиганда, так как их подвижность зачастую оказывается существенно огранченной из-за образования водородных связей либо из-за стерических затруднений. В то же время, недостаточное сэмплирование этих мостиковых молекул в некоторых случаях может приводить к ошибкам в несколько ккал/моль, что является неприелемым при оптимизации лекарственных кандидатов. Для решения данной проблемы предложено большое количество различных подходов, цель которых главным обрзом сводилась к определению прочности связывания отдельных мостиковых молкул воды. В то же время, ни в одной из известных работ не был проведён систематческий анализ стабильности сольватации комплекса белок-лиганд. Подобный анлиз, с одной стороны, позволил бы оценить корректность расчётов свободной энегии и выявить альтернативные варианты расположения мостиковых молекул воды, а с другой - помог бы определить основные сайты сольватации и предложить напраления для дальнейших модификаций лигандов. Таким образом, разработка методлогии оценки временной стабильности сольватации комплекса белок-лиганд при расчётах методом ВСЭ является актуальной и не решённой на сегодняшний день проблемой.

Недостаточность сэмплирования может возникать и в ходе молекулярной динмики свободного лиганда в воде при наличии у него медленно переходящих друг в друга конформаций. Пренебрежение конформацинонным равновесием лиганда мжет вносить в итоговую энергию связывания значительную ошибку (порядка нскольких ккал/моль). Решению этой, а также схожей проблемы медленных конфомационных переходов в белках посвящено большое количество теоретических рбот. Тем не менее, в большинстве случаев предложенные методы отличаются низким быстродействием и сложностью практической реализации, хотя и позволяли сущственно уменьшить ошибку расчётов свободной энергии связывания. Создание унверсального и эффективного способа анализа конформационного равновесия лигада и белка позволило бы не только повысить точность метода ВСЭ, но и выявить дполнительные направления модификации структуры лиганда с целью снижения конформационной энергии.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в создании мтодологии учёта вкладов конформационного равновесия и сольватации в свободную энергию образования комплекса белок-лиганд для направленного дизайна и синтеза новых биологически активных соединений. Для достижения данной цели были пставлены следующие задачи:

1. Создание эффективного метода расчёта конформационного равновесия органческих соединений с явным учётом растворителя;

2. Разработка метода выявления и учёта (в свободной энергии связывания) раличных сольватационных состояний комплекса белок-лиганд, находящихся в динмическом равновесии;

3. Направленный дизайн новых ингибиторов Syk-киназы и поли(АДФ-рибозаполимеразы (PARP) с использованием разработанных методов;

4. Синтез новых ингибиторов Syk-киназы и сопоставление экспериментальных данных по активности с результатами моделирования.

Научная новизна. Впервые предложен подход к моделированию конформацонного равновесия органических соединений с явным учётом растворителя, оснванный на расчётах методом ВСЭ с использованием равновесного значения двгранного угла в качестве реакционной координаты. Разработанный способ применим как для небольших органических молекул, так и для белков, и характеризуется всокой точностью (погрешность получаемых значений свободной энергии составляет 1 кДж/моль). Рассчитываемые значения относительной заселённости конформеров могут использоваться для учёта конформационного равновесия при моделировании связывания лигандов с терапевтическими мишенями, а также могут представлять одельный практический интерес для структурной органической химии. Применение предложенного метода показало, что заселённости связывающихся с белком коформеров в серии ингибиторов могут существенно (в 10-50 раз) отличаться друг от друга, и, таким образом, вносить значительный вклад в итоговое значение свободной энергии связывания. При этом относительные доли конформеров, рассчитанные в вакууме, существенно отличались от заселённостей в воде, что указывало на значтельно влияние растворителя на конформационное равновесие.

Впервые предложен метод выявления альтернативных сольватационных состяний комплекса белок-лиганд, основанный на определении корреляции сольватацонных карт системы. Практическое применение метода показало, что прочность комплексов PARP-ингибитор, рассчитанная по альтернативным сольватационным состояниям, может отличаться на 4-5 кДж/моль, и, таким образом, вносить сущственный вклад в точность расчётов. Стоит отметить, что стандартные критерии (временная зависимость координат атомов белка или энергии системы) не позволили определить изменения структуры воды в ходе расчётов исследованных систем.

Практическая значимость. На основе результатов, полученных с примененем разработанных методов, был проведен направленный синтез новых ингибиторов Syk-киназы 2,4-диариламиноазинового ряда. Синтезированные соединения проявили ингибирующую активность в наномолярном диапазоне концентраций и являются перспективными кандидатами для терапии некоторых заболеваний, таких как ревмтоидный артрит и неходжкинская лимфома.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в международных научных журналах и 2 тезиса в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, озора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложна на страницах машинописного текста, содержит рисунка и таблицы. Список цитируемой литературы включает 106 наименований.

Сокращения, принятые в тексте. ВСЭ – возмущение свободной энергии, КФ – конформационная фокусировка, PARP – поли(АДФ-рибоза)-полимераза (pol(ADP-riboso)-polymerase), Syk – селезёночная тирозинкиназа (spleen tyrosine kinase).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный общему описанию метода возмущения свободной энергии, а также существующим подходам к учёту конформационного равновесия и сольватации при связывании лигандов с белками.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Пакеты программ, использованные в работе. Молекулярно-динамические расчёты, анализ траекторий и расчёты изменения свободной энергии методом ВСЭ проводились с помощью программного пакета Gromacs 4.5.4 [J. Chem. Theory Comput., 2008, 4, 3, 435-447]. Для построения трёхмерных карт плотности молекул воды использовалась программа gridcount [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2003, 100, 12, 7063-8]. Для квантово-механической оптимизации трёхмерных структур лигадов и определения их топологических параметров применялись программы ACPYPE [BMC Res Notes, 2012, 5, 367] и AmberTools 1.5 [J. Comput. Chem., 2004, 25, 9, 11574]. Молекулярный докинг лигандов проводился с помощью программы Lead Finder [J. Chem. Inf. Model., 2008, 48, 12, 2371-85].

Расчёт относительной свободной энергии связывания. Начальные координты комплексов белок-лиганд рассчитывались на основе трёхмерных структур мишней из базы данных PDB [J. Mol. Biol., 1977, 112, 3, 535-42] с помощью метода молкулярного докинга. Относительная свободная энергия связывания ингибиторов Syкиназы и PARP определялась на основании результатов переходов соответствующих лигандов друг в друга в воде и в белковом окружении. Изменение кулоновских и Ван-дер-Ваальсовых параметров в методе ВСЭ проводилось через 10 промежутоных состояний, что являлось достаточным для обеспечения необходимого перекрвания фазовых пространств между соседними состояниями. Длина траектории при расчёте переходов в воде составляла 2 нс, в белке – 5 нс для каждого ?. Ошибка оцнивалась методом блок-среднего по 5 блокам.

Для оценки степени перекрывания фазовых пространств рассчитывалась фунция [The Journal of Chemical Physics, 2004, 121, 18, 8742-8747]:

? [ ( ) ] ? (1) где ( ) – W-функция Ламберта, являющаяся решением уравнения , <:количество точек, используемых для расчёта свободной энергии, и и – оносительные энтропии состояния A и B.

Расчёт конформационного равновесия лигандов Syk-киназы. Конформационые переходы в расчётах ВСЭ проводился плавным изменением потенциала двгранного угла в соответствии с формулой:

( ) ( [ ( ) ]) (2) где – силовая константа, – кратность двугранного угла, и – 180 и -180°, – шаг перехода. Для расчёта энергии конформационного перехода использовался следующий набор значений ?: от 0 до 0,45 и от 0,6 до 1,0 – с шагом 0,0125, от 0,45 до 0,6 – с шагом 0,05. Усреднение проводилось по траектории длиной 2 нс.

Анализ сольватации комплекса белок-лиганд. Анализ проводился для солватационных карт комплекса белок-лиганд, полученных усреднением позиций атмов кислорода молекул воды по траектории длиной 500 пс. Корреляция двух карт i и j (далее «корреляция карт плотности») рассчитывалась по формуле [J. Phys. Chem. B, 2011, 115, 2, 319-28]:

? ( ) ( ) где ( ) – ковариация между картами плотности и :

( ) ? (? ? ( )) ( ? ? ( )) (4) где ( ) – плотность молекул воды в ячейке x,y,z. Аналогичным образом рассчтывалась последовательная корреляция карт плотности растворителя, полученных по i и i+1 участку траектории, а также двумерная матрица корреляции (i, j). Двуменая матрица подвергалась последующей кластеризации с выделением участков с всокой совместной корреляцией в отдельные блоки.

Экспериментальное определение связывания ингибиторов с PARP и Syкиназой. Экспериментальное определение ингибиторной способности соединений по отношению к Syk-киназе проводилось по методике с ?-33P меченым АТФ (сумарная концентраций АТФ 10 мкМ). Определение ингибиторной способности ингбиторов PARP было выполнено в Институте химической биологии и фундаменталной медицины СО РАН) в соответствии с методикой [Mendeleev Commun., 2012, 22, 1, 15-17].

В третьей главе представлены результаты исследования и их обсуждение.

), концентрация связывающегося с белком конформера составляет:

[ ] где [ ] – общая концентрация лиганда в растворе, равная [ ] [ ]. Если в ходе моделирования методом молекулярной механики конформеры и не переходят друг в друга, то при расчёте методом ВСЭ (например, при расчёте абсолютной свбодной энергии связывания) полученное значение ?G соответствует константе рановесия связывания белка (P) и конформера [ ]:

[ ][ ] в то время как экспериментально определяемому значению соответствует не равновесная концентрация [ ], а общая концентрация лиганда [ ] :

[ ][ ] Таким образом, поправка, вносимая фокусировкой на конформере , в данном слчае составляет:

представляет собой относительную заселённость конформера и определяется на основании расчётов методом ВСЭ:

[ ] где – свободная энергия перевода конформера в , рассчитываемая методом ВСЭ. Если лиганд имеет более двух конформеров в растворе (обозначим их ), -то итоговое значение имеет вид:

структуре лигандов и , см. рис. 1). АнРис. 1. Термодинамический цикл для расчёта логичные выкладки в данном случае протносительной свободной энергии связывводят к следующей формуле: ния с учётом КФ.


Страницы: 1  2