Публикации 12.09.2011

12.09.2011 Ранняя диагностика и лечебно-профилактические мероприятия у лиц старших возрастных групп для предотвращения остеопоротических переломов

12.09.2011 Радиационно-термическая активация диффузионного массопереноса в оксидной керамике

12.09.2011 Управление производственным развитием текстильных предприятий

12.09.2011 Повышение эффективности поршневых двигателей внутреннего сгорания путем использования тепловых аккумуляторов энергии

12.09.2011 Разработка методов расчета и конструктивных решений балок с однорядной и двухрядной перфорацией стенки

12.09.2011 Инженерные методы обеспечения качества молока

12.09.2011 Разработка технологии прессования гетерофазных увлажненных механических смесей на основе железа для получения высокоплотных заготовок

12.09.2011 Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки

12.09.2011 Локальные геолого-динамические факторы формирования комплексных прибрежно-морских россыпей тяжелых минералов

12.09.2011 Механизм, кинетика образования и выращивание нелинейных кристаллов для оптоэлектроники

12.09.2011 Система хирургической реабилитации пациентов с эндотелиальной патологией роговицы

12.09.2011 Оценка геоэкологической ситуации и способы снижения деструкции окружающей среды в угледобывающих промышленных регионах

12.09.2011 Функциональные инварианты в задачах локальной аналитической классификации

Другие разделы


Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки

Автор Гилева Ирина Павловна, 12.09.2011

Страницы: 1  2  3 

ГИЛЕВА

Ирина Павловна РЕКОМБИНАНТНЫЕ ЦИТОКИНЫ И ЦИТОКИН-СВЯЗЫВАЮЩИЕ

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Кольцово - 2011 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Щелкунов Сергей Николаевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Загребельный Станислав Николаевич доктор биологических наук, профессор Кратасюк Валентина Александровна доктор биологических наук, профессор Меркулова Татьяна Ивановна Ведущая организация: ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов», г. Санкт-Петербург. Защита состоится «11» ноября 2011 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел.: (8-383)336-74-28. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан ______ 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г.П. Трошкова

Актуальность проблемы. Гормоны и цитокины обеспечивают согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем человека в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия. Недостаток гормонов и цитокинов является причиной многих заболеваний человека (например, диабет при недостатке инсулина или нарушение гемопоэза при недостатке гемопоэтических факторов), коррекция которых возможна соответствующими препаратами экзогенного происхождения. Антивирусная, иммуномодулирующая и антипролиферативная активность цитокинов - интерферонов, фактора некроза опухолей (TNF), факторов кроветворения - делает перспективными их использование в качестве лекарственных средств. Выделение биологически активных веществ (БАВ) белковой природы из природных источников (донорского материала или тканей животных) малоэффективно из-за низких концентраций целевых продуктов или невозможна из-за иммунологической несовместимости. С другой стороны, гиперпродукция цитокинов лежит в основе патогенеза многих тяжелых заболеваний человека (в случае гиперпродукции TNF - ревматоидного артрита, менингита, септического шока, кахексии и др.).

Фундаментальные достижения молекулярной биологии, молекулярной генетики и энзимологии легли в основу возникновения в 70-х гг. прошлого века генетической инженерии или технологии создания рекомбинантных молекул. Суть этой технологии состоит в соединении in vitro фрагментов ДНК из различных источников и последующем введении «искусственной» ДНК в живую клетку, где она способна реплицироваться, а кодируемая ею информация - экспрессироваться. Наиболее наглядным примером успеха такой методологии является создание новых эффективных лекарственных средств на основе БАВ белковой природы – рекомбинантных гормонов и цитокинов.

К моменту начала работ по теме диссертации было показано, что экспрессия в клетках Escherichia coli генов цитокинов – интерферона ?-2 (Nagata et al., 1980; Goeddel D.V. et. al., 1981) или GM-CSF (Burgess A.W. et. al., 1987) позволяет выделить из бактериальных клеток биологически активные рекомбинантные белки. Сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская область) и Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина (г. Москва) методом прямого химического синтеза был получен и клонирован в бактериальной плазмиде (pLeIFlac) синтетический ген ifn ?-2 человека (Колосов М.Н. и др., 1984). Необходимым продолжением этих работ является разработка стратегии создания высокопродуктивных штаммов E. coli, обеспечивающих синтез таких важнейших для медицины БАВ, какими являются интерферон и GM-CSF.

В работах ряда исследователей (Щелкунов С.Н., 1995; Alcami A., 2003; Lukas A., McFadden G., 2004) высказаны предположения о возможности использования вирусных иммуномодуляторных белков для антицитокиновой терапии. Получение таких белков в биологически активной форме возможно в ряде случаев только в эукариотических клетках. Удобной системой для решения этой задачи является бакуловирусная система экспрессии.

Настоящая диссертационная работа посвящена конструированию штаммов-продуцентов интерферона ??2b и GM-CSF человека на основе бактерии E. coli, а также рекомбинантных бакуловирусов, содержащих в своем геноме гены ортопоксвирусных TNF-антагонистов, и изучению свойств рекомбинантных белков, выделенных из бактериальных клеток и инфицированных клеток насекомых.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных цитокинов – интерферона ?-2b человека (hIFN?-2b), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (hGM-CSF) и эукариотических продуцентов TNF-cвязывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян (VARCrmB, CPXV-CrmB, МPXV-CrmB), а также изучение физико-химических и биологических свойств этих рекомбинантных белков.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-сконструировать рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых генов в бактериальных клетках E.coli;

-изолировать из вирусных геномов гены TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян и получить рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие гены вирусных TNсвязывающих белков в клетках насекомых;

-выделить из клеток штаммов-продуцентов и изучить физикхимические и биологические свойства полученных рекомбинантных белков (hIFN?-2b, hGM-CSF, VARV-CrmB, CPXV-CrmB и МPXCrmB);

-оценить терапевтический потенциал рекомбинантных белков hGCSF и VARV-CrmB.

Научная новизна и практическая значимость результатов исследования. Впервые получены рекомбинантные бакуловирусы BTRi67 и BTRz96, детерминирующие в клетках насекомых линии Sf21 синтез TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы обезьян (белков VARи MPXV-CrmB), и впервые проведено сравнительное изучение свойств белков VARV-CrmB, СPXV-CrmB и MPXV-CrmB in vitro. Впервые оценен TNF-нейтрализующий потенциал белка VARV-CrmB относительно некоторых TNF-антагонистов (клеточных TNF–рецепторов, поликлональных антител, TNнейтрализующего моноклонального антитела МАК 195, коммерческого препарата Ремикейд) на клетках мышиных фибробластов линии L929. Впервые показана TNF-нейтрализующая активность белка VARV-CrmB in vivo: увеличение количества выживших животных в экспериментальной модели эндотоксического шока и снижение МuTNиндуцированной подвижности дендритных клеток кожи мышей линии Balb/с. Впервые показана нейтрализация белком VARV-CrmB эффектов МuTNF на модели костномозгового гемопоэза мышей Balb/c.

Сконструированы оригинальные рекомбинантные ДНК, обеспечивающие эффективный синтез в клетках E.coli продуктов экспрессии синтетических генов ifna-2b и gm-csf человека. Получен и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов высокоэффективный штамм E.coli SG20050/рIF16 (5809) – продуцент рекомбинантного интерферона ??2b человека с выходом целевого продукта 3-4 х 107 МЕ/мл/109 кл. На основе этого штамма в ГНЦ ВБ «Вектор» разработана технология получения субстанции интерферона ?-2b и его лекарственных форм. Получен и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов штамм E.coli SG20050/p280GM (B-6613) – первый отечественный продуцент рекомбинантного GM-CSF человека, обеспечивающий выход целевого продукта в количестве 20-50 мг/л клеточной суспензии. Показано, что продукт экспрессии синтетического гена gm-csf в клетках E.coli видоспецифически стимулирует гранулоцитарно-макрофагальную дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток и дендритных клеток. Получен штамм-продуцент и препарат рекомбинантного MuTNF, что позволило использовать этот рекомбинантный белок в экспериментальных моделях при изучении терапевтического потенциала поксвирусных TNF-антагонистов.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международный симпозиум «Регуляция трансляции», Рига (1989); III-я Всесоюзная конференция «Макромолекулы и клетки», Москва, Россия (1989), 2nd International conference “AIDS, Cancer and Human Retroviruses, St. Petersburg, Russia (1992); XI Poxvirus and Iridivirus Meeting, Toledo, Spain (1996); 2nd Russian Principal Investigator Conference, Holland (2001); Международная школа - конференция «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, Россия (2002); 1st International Congress BIOTECHNOLOGstate of the art&prospects of development, Moscow, Russia (2002); Workshops ”Review of Cooperative Biodefense Research Projects, Serpukhov, Russia (2002), St. Petersburg, Russia (2003); International conference “Chemical and biological problems of proteomics”, Novosibirsk, Russia (2004); CBR annual review conference, St. Petersburg, Russia (2004); 12th International Congress of Immunology, Montreal, Canada, (2004); XVth International Poxviral and Iridoviral Symposia, Oxford, UK (2004); Всероссийский научный симпозиум с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск, Россия, (2005); 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary (2006); Научно-практическая конференция «Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики», Харків, України, (2006); 17th International Poxvirus and Iridovirus Conference, Grainau, Germany, (2008); XIV International congress of virology, Istanbul, Turkey (2008); Всеросийская научно-практическая конференция «Современные представления об иммунокоррекции», Пенза, Россия, (2008); 18-я Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, Россия (2009); Всероссийская научная конференция «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск, Россия (2010).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список работ, опубликованных по теме диссертации, и библиографический список. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста и включает 126 рисунков и 50 таблиц. Библиографический список содержит 643 источника.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспрессия генов в составе искусственных полицистронных оперонов с сопряженной трансляцией позволила создать бактериальные суперпродуценты рекомбинантных белков:

-интерферона ?-2b человека с продуктивностью около 60% от суммарного клеточного белка;

-гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека с продуктивностью 15% от суммарного клеточного белка;

-фактора некроза опухолей мыши с продуктивностью 15-20% от суммарного клеточного белка.

2. Гены crmB вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян в составе генома рекомбинантных бакуловирусов детерминируют синтез в клетках насекомых белков, ингибирующих цитотоксическое действие TNF на клетках мышиных фибробластов дозозависимым образом.

3. Видоспецифические отличия в аминокислотных последовательностях белков VARV-CrmB, СPXCrmB и MPXV-CrmB обуславливают различия их физико-химических и биологических свойств.

4. Белок VARV-CrmB обладает TNF-нейтрализующей активностью in vivo.

Работа выполнялась в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор в рамках научных тем организации, по гранту Международного научно-технического центра #1685 «Разработка нового терапевтического препарата на основе ортопоксвирусного белка, связывающего фактор некроза опухолей человека», по грантам РФФИ 06-04-48074а и 10-04-00387а, в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России, госконтракт № 100430/--3052/266.

Конструирование рекомбинантных плазмид для экспрессии природных и синтетических генов в клетках E. coli выполнено автором лично и в соавторстве с В.В. Кравченко, Т.С. Бондарь (НИКТИ БАВ, г. Бердск) и В.Н. Добрыниным, С.А. Филипповым, В.Г. Коробко (ГУН Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва). Физико-химический анализ рекомбинантных белков hIFN??2b и hGM-CSF выполнен автором лично и в соавторстве с З.А. Акименко, С.И. Ястребовым, В.И. Офицеровым (ЗАО «ВектоБест», г. Новосибирск). Изучение свойств штаммов-продуцентов E.coli SG20050/pIF16 и E.coli SG20050/p280GM проведено в соавторстве с И.А. Андреевой (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»,) и Н.В. Наумовой (ЗАО «ВектоМедика», р.п. Кольцово). Выделение рекомбинантных белков hIFN?-2b, hGM-CSF и MuTNF проведено в cоавторстве с Л.Р. Лебедевым, В.П. Романовым, Н.М. Пустошиловой (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово), А.Н. Закабуниным и Ю.Н. Козловой (ГУН ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск). Изучение биологических свойств рекомбинантного hGM-CSF проведено в соавторстве с С.К. Халдояниди, И.А. Орловской, Л.Б. Топорковой, Л.В. Сахно, С.В. Сенниковым (ГУН НИИКИ СО РАМН, г. Новосибирск). Изучение CrmB-белков ортопоксвирусов выполнено автором под общим руководством С.Н. Щелкунова. Конструирование рекомбинантных бакуловирусов BTRi67, BTRz96 и BTRgr90 проведено И.А. Рязанкиным, З.А. Максютовым, А.В. Тотмениным при участии автора. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей CrmB-белков проведен А.В. Тотмениным и Д.В. Антонецом (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово). Выделение CrmB-белков проведено Л.Р. Лебедевым (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово). Изучение физико-химических и иммунологических свойств CrmB-белков проведено автором лично и в соавторстве с И.А. Рязанкиным, Н.М. Пустошиловой и Г.Н. Афиногеновой (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово). Изучение TNF-нейтрализующих эффектов CrmB-белков на клетках линии L929 и на модели ЛПС-индуцированного септического шока проведено автором лично, Т.С. Непомнящих под руководством автора и совместно с Г.В. Кочневой и А.A. Гражданцевой (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово). Изучение TNF-нейтрализующих эффектов белка VARCrmB в экспериментальных моделях костномозгового колониеобразования и ингибирования миграции клеток Лангерганса выполнено совместно с Л.Б. Топорковой, И.А. Орловской, Е.А. Вязовой (ГУН НИИКИ СО РАМН, г. Новосибирск). Автор также приносит благодарность настоящим и бывшим сотрудникам ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», внесшим свой вклад в проведение настоящего исследования - В.А. Лихошваю, В.В. Шамину, О.И. Серпинскому, Е.И. Рябчиковой, Е.М. Малковой, И.В. Виноградову, В.А. Агеенко и сотрудникам отдела Геномных исследований и разработки методов ДНК-диагностики поксвирусов. Особую благодарность автор выражает к.х.н. В.В. Кравченко - инициатору изучения механизмов экспрессии генов в составе полицистронных оперонов и Е.А. Каргиновой за радость совместной работы, д.б.н., профессору С.К. Василенко, отношение которого к жизни и науке являются примером.

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ (16 статей в научных журналах и сборниках научных трудов). Часть результатов защищена патентами (4 Патента РФ). Патент РФ № 2241754 включен в список 100 лучших патентов России за 1997-2007 гг.

Взаимосвязанная трансляция генов бактериальных оперонов позволяет предположить целесообразность использования этого принципа при конструировании экспрессионных плазмид. В работах (Кравченко В.В. и др., 1987, 1988) показано, что наиболее эффективная экспрессия полусинтетического гена lacZ, находящегося в составе искусственного полицистронного оперона, наблюдается, когда его последовательность SD перекрывается или находится в непосредственной близости с терминирующим кодоном предшествующего гена В-белка фага М13. Высокий уровень экспрессии дистального гена оперона достигается за счет эффективной инициации трансляции, которая становится возможной благодаря разрушению вторичной структуры мРНК, происходящему в процессе трансляции проксимального гена. Рекомбинантные плазмиды pDSt01+ и pDSt02+ (Stueber D., Bujard H., 1982), физические карты которых представлены на рис. 1, использовали в качестве исходных векторных молекул.

Клонированием PstI/EcoRI-фрагмента плазмиды pSK-381 (Серпинский и др., 1982), содержащего начало гена bla, промотор PVIII и ген белка оболочки (В-белка) фага М13mp7 без 4-х С-концевых кодонов, и синтетического EcoRI/BamHI-адаптера в плазмиде pDSt01+ получена плазмида pDSpV1, физическая карта которой представлена на рис. 2А. Эта плазмида представляет искусственный полицистронный оперон, в котором область стыка генов В-белка и dhfr организована таким образом, что SD-последовательность дистального гена оперона перекрывается с терминирующим кодоном проксимального, как это изображено на рис. 3А.

Рис. 1 Физическая карта плазмид pDSt01+ и pDSt02+. bla-, dhfcaгены лактамазы, дигидрофолатредуктазы и хлорамфениколацетилтрансферазы, соответственно; ori - область начала репликации; t0 - терминатор транскрипции фага ?. Указано положение сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции XhoI, EcoRI, BаmHI, HindIII, NcoI, XbaI и PstI.

А. Б. Рис. 2 Физические карты плазмид pDSpV1 (A) и pIF6/8 (Б). Указаны гены bla, dhfr, cat и ifn?-2; терминатор транскрипции t0 фага ?, полилинкер (pl), а также положение сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI. Подчеркнуты снизу терминирующие кодоны, сверху – перекрывание последовательности SD и кодона терминации.

2 1 0 Б.

SFSLSTNLQESLRSKE* Рис. 4 Нуклеотидные последовательности искусственного (А) и природного (В) генов ifn?-2b и кодируемые ими аминокислотные последовательности IFNa-2b. Подчеркнуты нуклеотиды искусственного гена, отличающиеся от природного. Сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции PstI выделен жирным курсивом. Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки R23, H34 позволяющие типировать синтетический ген как ifn?-2b.

Физическая карта плазмиды pIF6/8 и последовательность нуклеотидов в области стыка генов В-белка и ifn??2b представлены на рис. 2Б и рис. 3Б, соответственно. В этой плазмиде ген dhfr уже не входит в полицистронный оперон.

При конструировании плазмиды p381IFN с помощью синтетического олигонуклеотидного адаптера, структура которого представлена на рис. 5, изменили структуру гена ifn??2b, что не привело к изменению соответствующей аминокислотной последовательности. В результате реконструкции одна из замен G A приводит к утрате сайта PstI в гене интерферона, другая изменяет терминирующий кодон TAG TAA. Также при встройке адаптера происходит утрата сайта узнавания EcoRI-934 плазмиды pDSt02+, что позволяет заменой PstI/EcoRI-фрагмента плазмиды p381IFN на соответствующий фрагмент, содержащий тандем промоторов и часть лидерного пептида триптофанового оперона E.coli, получить плазмиду p280IFN.

G G --pDS381 ----------------------------pIF6/8------------------------------------------A----------------------------------Рис. 5 Отличия структуры гена ifn?-2b в плазмиде p381IFN от его структуры в плазмиде pIF6/8.

2. Эффективность экспрессии генов в составе искусственных полицистронных оперонов Полученными плазмидами pDSpV1, рIF6/8, p381IFN и p280IFN трансформировали клетки E.coli SG20050 и индивидуальные AprTcтрансформанты использовали для получения клеточных лизатов, которые анализировали с помощью электрофореза в 12% SDS-ПААГ и методом радиоиммуноанализа (РИА). Результаты электрофоретического фракционирования суммарных лизатов клеток E.coli SG20050/pDSpV1 и SG20050/pIF6/8 представлены на рис. 6. Плазмиды pDSpV1 и pIF6/8, по сравнению с контрольной плазмидой pLeIFlac, детерминируют синтез новых полипептидов, составляющих мажорные полосы на фоне остальных клеточных белков, которые по молекулярным массам соответствуют дигидрофолатредуктазе мыши (22 кДа) и альфа-2 интерферону человека (кДа), соответственно.

1 2 3 4 Рис. 6 Фракционирование лизатов клеток E.coli SG20050/pDSpV1 (2) и E.coli SG20050/pIF6/8 (4) в 12% SDS-ПААГ. 1 – лизат клеток E.coli SG20050/pLeIFlac; химотрипсиноген (25 кДа) и миоглобин (17 кДа), соответственно.

Плазмида pIF6/8 позволяет количественно оценить уровень экспрессии генов искусственного бицистронного оперона путем измерения количеств белков В и IFNa-2b, синтезирующихся в клетках E.coli, несущих эти плазмиды. Результаты РИА представлены в табл. 1.

лизатах клеток E.coli SG20050/pDSpV1 и E.coli SG20050/pIF6/8.

pIF6/8 32 1600 Можно видеть, что уровень экспрессии дистального гена (ifn?-2b) практически в 50 раз превышает уровень экспрессии проксимального (VIII), т.е. наблюдается эффект усиления экспрессии целевого гена в результате трансляционного сопряжения.

Экспрессионные свойства плазмид pIF6/8, p381IFN и p280IFN исследовали определением процентного содержания IFN?-2b в клетках E.coli денситометрией. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 2.

Увеличение в клетке количества копий определенного гена вызывает повышение уровня его продукта. Представляет интерес исследование экспрессии повторяющихся генов, находящихся в составе полицистронного оперона. Для направленной дупликации генов ifn?-2b PstI-фрагмент плазмиды pLeIFlac, содержащий начало гена bla, 5концевую часть ifn?-2b, PstI/EcoRI-адаптор в виде комплементарных дезоксиолигонуклеотидов длиной 30 и 38 п.о. и PstI/EcoRI-фрагмент плазмиды pDSt02+ использовали для получения промежуточной плазмиды р95IFN. Для получения тандема генов ifn??2b PstI/EcoRфрагменты плазмид р95IFN и p381IFN в присутствии адаптера лигировали с интерферон-содержащими PstI-фрагментами плазмид pLeIFNlac и pIF6/8, получая в результате плазмиды р95/2IFN и p381/2IFN, соответственно. Заменой PstI/EcoRI фрагмента плазмиды p381/2IFN на соответствующий PstI/EcoRI фрагмент плазмиды pDS280 получили плазмиду р280/2IFN. На рис. 7 схематически изображена структурно-функциональная организация полицистронных оперонов под контролем промоторов Plac (р95/2IFN; ifn?-ifn?), PVIII (p381/2IFN; IX–VIII-ifn?-ifn?) и Ptrp (р280/2IFN; L-ifn?-ifn?).

Клетки E.coli SG20050 трансформировали плазмидами pIF6/8, р381IFN, р280IFN, р95/2IFN, р381/2IFN и р280/2IFN и определяли в суммарных лизатах клеток уровень синтеза IFN?-2b денситометрией. Относительный уровень синтеза интерферона представлен в табл. 3, а результаты фракционирования суммарных лизатов плазмидосодержащих клеток - на рис. 8. р95/2IFN --AGGA-----11n---ATG________ ifn?__________ ifn?______TAA p381/2IFN ----IX--------ATGA------VIII----TAAGGA----8n---ATG________ ifn?____ifn?___TAA--р280/2IFN ---trpL ----TAAGGA----8n---ATG________ ifn?__________ ifn?______TAA--pIF16 ---trpL ----TAAGGA----8n---ATG________ ifn?__________ ifn?______TAA--Рис. 7 Структурно-функциональная организация сигналов инициации трансляции генов интерферона в составе полицистронных оперонов плазмид р95/2IFN, р381/2IFN, р280/2IFN и pIF16 (раздел 5). Инициирующие и терминирующие кодоны генов ifn?-2b выделены жирным курсивом, последовательности TSD (TAAGGA) – подчеркнуты. Цифрами обозначено расстояние в нуклеотидных остатках между соответствующими регуляторными сигналами. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Рис. 8 Фракционирование суммарных лизатов клеток E.coli SG20050\р95/2IFN(9, 10), E.coli SG20050\pIF6/8 (1, 2), E.coli SG20050/p381IFN (3, 4), E.coli SG20050\р381/2IFN (5 -8), E.coli SG20050\р280IFN (11, 12) и E.coli SG20050\р280/2IFN (13, 14) в 12% SDS-ПААГ. Положение интерферона ?-2b указано стрелкой.

Уровень синтеза интерферона, детерминируемый плазмидой р95/2IFN, гораздо ниже, чем у вариантов, содержащих одну копию гена - pIF6/8 и p381IFN, а варианты р381/2IFN и p280/2IFN значительно превышают возможность своих аналогов с одной копией гена. Полученные результаты свидетельствуют, что сигнал инициации трансляции, расположенный между двумя генами ifn?-2b, функционирует только в случае эффективной трансляции предыдущего цистрона.

Внутриклеточную локализацию продукта экспрессии искусственного гена ifn??2b определяли, разделяя после ультразвуковой дезинтеграции растворимую и нерастворимую в физиологической буферной системе фракции клеточных белков. Экстракцию IFN?-2b из «телец включения» проводили 7.5 М солянокислым гуанидином (рис. 9А). Методом ВЭЖХ на широкопористом носителе «Полисил ОДС-300» гуанидинхлоридную фракцию IFN?-2b дочищали до практически гомогенного состояния (рис. 9Б, дорожка II) и такой препарат использовали для структурных исследований.

Установлено, что аминокислотный состав исследуемого полипептида соответствует теоретически ожидаемому, N-концевым остатком является цистеин, а последовательность пяти N-концевых аминокислот C-D-L-P-– соответствует структуре лейкоцитарного интерферона человека (рис. 4). концевые аминокислотные остатки пептидов, образующихся при гидролизе исследуемого полипептида бромцианом (лейцин, аргинин, изолейцин, лизин и цистеиновая кислота), соответствуют структуре IFN?-2b (рис. 4). Исчерпывающий гидролиз полипептида карбоксипептидазами А и В, а также карбоксипептидазой Р показал, что образующаяся смесь аминокислот также соответствует С-концевой структуре IFN?-2b. Удельная активность препарата (фракция II), определенная по подавлению цитопатического действия вируса энцефаломиокардита мышей на культуре клеток легкого эмбриона человека 68, составила 108 МЕ. А. Б.

1 2 3 4 5 I II Рис. 9 Выделение IFN?-2b. А. Электрофоретический анализ фракций выделения продукта экспрессии синтетического гена ifn?-2b в E.coli. 1 - суммарный лизат клеток E.coli SG20050\р280/2IFN; 2 – супернатант после ультразвуковой дезинтеграции клеток; 3, 4 – осадок и супернатант после обработки буфером PBS с 6М мочевиной, соответственно; 5 – cупернатант после обработки фракции 3 солянокислым гуанидином (7.5М) в буфере PBS. Б. Хроматография IFN?-2b на широкопористом обращено-фазовом носителе «Полисил ОДС-300» (колонка 2.3х40 мм). Элюцию белков проводили градиентом смеси ацетонитрила, изопропанола и воды (3:1:1) в 50% муравьиной кислоте. Электрофоретический анализ белковых фракций, соответствующих пикам I и II представлен на дорожках I и II.

Проведенный химический и биологический анализ структуры и свойств продукта экспрессии синтетического гена ifn??2b свидетельствует о его соответствии природному аналогу, а высокий уровень синтеза целевого рекомбинантного белка в разработанной экспрессионной системе позволяет создать штамм-продуцент, пригодный для внедрения в производство.

Плазмида pIF16, прототипом которой является плазмида р280/2IFN, содержит тандем генов ifn??2b под транскрипционным контролем тандема промоторов триптофанового оперона (Рtrpx2), но терминирующий кодон первого гена ifn?-2b и инициирующий кодон второго гена ifn?-2b разнесены путем встройки синтетического цистрона orf69, как это представлено на рис. 7. На рис. 10А приведена физическая карта плазмиды pIF16.

Плазмидой pIF16 трансформировали компетентные клетки E.coli SG20050 и суммарные лизаты клеток анализировали электрофорезом в 12% SDS-ПААГ (рис. 10Б). Содержание целевого белка в 1мл (109 кл/мл) культуры E.coli SG20050/pIF16, определенное методом РИА, составляет 250-300 мкг, и не менее 2-5 107 МЕ, определенное по подавлению цитопатического действия вируса энцефаломиокардита мышей на культуру клеток легкого эмбриона человека Л-68. Штамм E.coli SG20050/pIF16 депонирован в ВКПМ, коллекционный номер В-5809.

На основе этого штамма-продуцента в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» разработан способ получения субстанции интерферона альфа-2b (патент РФ №2123010, 1998), а ЗАО «Вектор-Медика» выпускает несколько видов лекарственных форм (Реаферон-ЕС, Реаферон-ЕС Липинт, Инфагель, Лайфферон).

Xba I (2013) А. Б. Рис.10 А. Физическая карта плазмиды pIF16. Б. Фракционирование в 12% SDS-ПААГ суммарных лизатов клеток E.coli SG20050/pIF16, E.coli SG20050/p280/2IFN и E.coli SG20050 в 12% SDS-ПААГ. М – Prestained SDS-PAGE Standards (Low Range, BioRad, США).

Универсальность предложенного способа конструирования экспрессионных плазмид проверялась путем экспрессии в составе искусственных бицистронных оперонов синтетического гена gm-csf человека и полусинтетического гена tnf мыши.


Страницы: 1  2  3