Список тем опубликованных работ
201. Генетическая структура и молекулярная филогеография народов Кавказа
Кутуев Ильдус Альбертович (02.08.2010)
... доктора биологических наук
Уфа 2010 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Учреждения Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Хуснутдинова Эльза Камилевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
...
202. Генетически кодируемые флуоресцентные инструменты для исследования живых систем
Чудаков Дмитрий Михайлович (09.03.2011)
... доктора биологических наук
Москва - 2011 Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Научный консультант: Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, Лукьянов С.А. Официальные оппоненты: Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Деев С.М. (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН) Доктор химических наук, профессор Савицкий А.П. (Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН) Доктор биологических наук, Васильев А.В. (Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН) Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова. Защита состоится "18" мая 2011 г. в 10.00 часов на заседании на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 совета при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10. С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Автореферат разослан " " 2011 г. Учёный секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В. А. ОЛЕЙНИКОВ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Клонирование в 1992 году гена зеленого флуоресцентного белка из гидромедузы Aequorea victoria (avGFP) положило начало разработке целого арсенала инструментов и методов для изучения живых систем. Были получены различные спектральные варианты флуоресцентных белков, позволяющие проводить эксперименты многоцветного мечения и визуализировать белок-белковые взаимодействия с использованием эффекта FRET (F?rster resonance energy transfer - ферстеровский перенос энергии), фотоактивируемые флуоресцентные белки, позволяющие проводить прицельное фотомечение и слежение за органеллами и клетками, генетически кодируемые сенсоры, позволяющие визуализировать активность ферментов и изменения в концентрации различных ионов, и другие инструменты. Тем не менее, многие достижения носили скорее теоретический характер. Можно выделить две ключевые проблемы, стоявшие перед разработчиками новых генетически кодируемых флуоресцентных инструментов. Первая - расширение палитры спектральных вариантов флуоресцентных белков до крайних областей видимого спектра – синей (максимум эмиссии флуоресценции при 440-460 нм) и дальнекрасной (максимум эмиссии флуоресценции выше 630 нм). Особый интерес, как эффективный инструмент для визуализации объектов в модельных животных, представляли дальнекрасные флуоресцентные белки, длинноволновое излучение которых наиболее эффективно проникает через толщу живых тканей. Полученные до настоящей работы варианты дальнекрасных флуоресцентных белков характеризовались крайне низкой яркостью флуоресценции и низкой фотостабильностью, что делало эти белки практически непригодными для реального применения. По тем же причинам, не находили применения на практике известные синие флуоресцентные белки. Вторая проблема состояла в том, что практически все открытые природные флуоресцентные белки (за исключением avGFP) имели олигомерную структуру и были непригодны для исследования локализации белков, отслеживания белок-белковых взаимодействий и других исследований, в которых требуется получение конструкций слияния с целевым белком. Полученные путем мутагенеза природных белков мономерные красные флуоресцентные варианты отличались низкой яркостью сигнала, и достаточно низким, по сравнению с природными мономерными зелеными флуоресцентными белками, качеством работы в составе белков слияния. Известные обратимо фотоактивируемые флуоресцентные белки характеризовались тетрамерной природой, что делало невозможным их применение для фотомечения исследуемых белков, в том числе для развивающихся технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Оставался также ряд других значимых проблем, решение которых было актуально на момент начала выполнения данной работы. Так, время полу-созревания хромофора составляло для большинства полученных флуоресцентных белков многие десятки минут и даже часы, что затрудняло их применение в экспериментальных системах, требующих быстрого появления флуоресцентного сигнала. Полученные генетически кодируемые сенсоры на основе флуоресцентных белков отличались низким динамическим диапазоном изменений флуоресцентного сигнала при ответе на детектируемые ионы или исследуемую активность, что существенно осложняло получение достоверных результатов. Настоящая работа была направлена на системное решение перечисленных выше проблем и создание панели эффективных молекулярных инструментов на основе флуоресцентных белков, способных вывести современные технологии микроскопии и in vivo имиджинга на качественно новый уровень. Цель работы. Создание нового поколения генетически кодируемых флуоресцентных инструментов для флуоресцентной микроскопии и визуализации структур и процессов в живых тканях. Задачи работы включали: 1. Получение полной палитры мономерных флуоресцентных белков, предназначенных для мечения целевых белков, характеризующихся высокой яркостью флуоресцентного сигнала, высокой скоростью созревания хромофора, высокой устойчивостью флуоресцентного сигнала к изменениям значения pH и фотообесцвечиванию. 2. Получение палитры ярких быстро созревающих флуоресцентных белков для мечения клеток и тканей. В том числе, получение ярких дальнекрасных флуоресцентных белков, предназначенных для эффективной визуализации объектов в модельных животных. 3. Получение генетически кодируемых сенсоров с высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа (далее - «высококонтрастных» сенсоров). 4. Получение мономерных фотоактивируемых флуоресцентных белков и разработка технологий их применения. Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе было получено новое поколение генетически кодируемых флуоресцентных маркеров и инструментов, существенно расширивших возможности для визуализации объектов и процессов при исследовании живых систем. Решение проблемы олигомеризации флуоресцентных белков позволило создать панель ярких мономерных флуоресцентных маркеров со спектрами флуоресценции, покрывающими всю область видимого спектра. Благодаря этому, стало возможным проводить многоцветное мечение целевых белков и органелл в живых клетках, существенно расширились возможности для отслеживания взаимодействия целевых белков и изменения внутриклеточных параметров с использованием эффекта FRET. Полученные мономерные фотоактивируемые флуоресцентные белки позволяют отслеживать перераспределение целевых белков в живых клетках, и применимы для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, в том числе двухцветной. Полученные яркие дальнекрасные флуоресцентные белки позволяют эффективно визуализировать клетки и ткани в теле интактных живых модельных организмов, а быстросозревающие флуоресцентные белки - регистрировать активность и исследовать динамику работы промотеров исследуемых генов. Получен ряд генетически кодируемых сенсоров, характеризующихся высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа, позволяющих достоверно детектировать изменения, происходящие в живых клетках. Принципы организации и флуоресцентные домены полученных сенсоров могут в дальнейшем служить основой для создания высококонтрастных сенсоров с различной специфичностью. Большинство полученных в данной работе инструментов и технологий уже сегодня находят широкое применение в области молекулярной и клеточной биологии, биологии развития, канцерогенеза, иммунологии, нейробиологии и фармакологии; они активно используются в сотнях лабораторий по всему миру, как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: «FEBS meeting on Advanced Light Microscopy» (Семмеринг, Австрия, 2005, приглашенный доклад), «The 32nd Lorne Conference on Protein Structure and Function» (Лорне, Австралия, 2007, приглашенный доклад), «3rd Annual FABLS Workshop» (Мельбурн, Австралия, 2007, приглашенный доклад), "Лазерная конфокальная микроскопия в биологии и медицине" (Звенигород, Россия, 2005, приглашенный доклад), Четвертая международная конференция "Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии" (Пущино, Россия, 2007, приглашенный доклад), «Fluorescent Proteins and Biological Sensors. Janelia Farm Conference.» (Вашингтон, США, 2007, приглашенный доклад), «Международная конференция им. Гельмгольца» (Москва, Россия, 2008, приглашенный доклад), «Symposium on Watching Biomolecules in Action» (Осака, Япония, 2009, приглашенный доклад), XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2008), "Molecular Imaging" (Крит, Греция, 2005), съезд Биохимического и молекулярно-биологического общества Германии (Мюнстер, Германия, 2004), «ASDD Symposium» (Москва-Кижи-Валаам-Санкт-петербург, Россия, 2004), «BIOCATALYSIS–2005» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), «BIOCATALYSIS–2007» (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 2007), Национальная конференция «Рентгеновское, Синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов» (Москва, Россия, 2009). Публикации по теме работы. По материалам диссертации опубликовано 42 статьи в российских и международных рецензируемых журналах, а также 2 главы в книгах. Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором или под его руководством, при непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Автор также осуществлял выбор направлений и методов исследования, анализ полученных данных и подготовку материалов к публикации. 1. Мономерные флуоресцентные белки для мечения целевых белков В составе химерных конструкций, флуоресцентные белки широко применяются для мечения исследуемых белков в живых клетках. Такое мечение позволяет решать целый ряд задач, включая визуализацию синтеза, локализации, транслокации, взаимодействий и деградации белков в различных биологических системах в режиме реального времени. Присоединение белковой метки, представляющей собой мономерный флуоресцентный белок, в большинстве случаев не нарушает, или почти не нарушает, естественной локализации и функций белка-мишени. Однако лишь немногие природные варианты флуоресцентных белков характеризуются мономерным состоянием при физиологических концентрациях. Следует считать огромной удачей для развития экспериментальной биологии, что первый клонированный флуоресцентный белок, avGFP, оказался естественным мономером. По этой причине, avGFP и его многочисленные производные варианты с флуоресценцией в голубой (циановой), зеленой, и желтой (максимумы эмиссии от 470 до 530 нм) областях спектра, такие как ECFP, Cerulean, EGFP, Emerald, EYFP, Citrine, Venus, и другие, сегодня широко применяются в составе белков слияния. В то же время, все известные природные красные флуоресцентные белки характеризуются димерной либо тетрамерной природой. Настоящая глава посвящена описанию получения и тестирования мономерных флуоресцентных белков. Для белка TagRFP и ветки его производных вариантов c эмиссией в красной и дальнекрасной областях спектра описание дается в хронологическом порядке (TagRFP-mKate-mKate2-FusionRed). Отдельно рассматриваются синий флуоресцентный белок TagBFP и белки, полученные на основе GFP из Aequorea macrodactyla, с эмиссией в средней части видимого спектра. 1.1. TagRFP: яркий красный мономерный флуоресцентный белок За основу для создания мономерного красного флуоресцентного белка нами был взят красный димерный (тетрамерный при высоких концентрациях) белок TurboRFP (раздел 2.2). С одной стороны, TurboRFP обладает предпочтительными характеристиками: высокой яркостью флуоресценции, высокой скоростью созревания хромофора, высокой устойчивостью к изменениям значения pH. С другой стороны, для высокогомологичного белка eqFP611 было ранее показано, что один из двух интерфейсов, отвечающих за тетрамеризацию, легко поддается дестабилизации без существенной потери спектральных характеристик и нарушения созревания хромофора. Эти данные давали основания надеяться, что мономеризация белка TurboRFP окажется менее трудоемкой, чем мономеризация белка DsRed, и завершится с меньшими потерями в яркости флуоресценции. С использованием известной на тот момент структуры белка eqFP611 (PDB ID: 1UIS) были определены основные точки в составе так называемого гидрофильного интерфейса, отвечающего за димеризацию белка TurboRFP. По результатам анализа, для дестабилизации взаимодействий по этому интерфейсу методом сайт-направленного мутагенеза были внесены точечные замены R162E, Q166D, S180N, F198V, и F200Y. Для дестабилизации взаимодействий по другому, гидрофобному, интерфейсу TurboRFP, была введена замена N126R, предотвращающая, по данным для белка eqFP611, межсубъединичные взаимодействия через этот интерфейс. По данным гель-фильтрационной хроматографии низкого давления, результирующий мутантный вариант характеризовался мономерной природой. Таким образом, введения этих замен оказалось достаточно для дестабилизации олигомерных форм TurboRFP. Несмотря на существенные изменения в структуре бета-бочонка, которые неизбежны при мономеризации, полученный мутантный вариант сохранил способность к формированию хромофора и проявлению флуоресцентных свойств. Тем не менее, как и ожидалось, мономеризация резко снизила скорость созревания и яркость флуоресценции. Для восстановления утраченных характеристик была использована комбинация методов случайного и сайт-направленного ПЦР-мутагенеза. В ходе проведения случайного мутагенеза, ключевые для сохранения мономерности аминокислотные позиции были закреплены с использованием специфических праймеров. После каждого раунда случайного мутагенеза проводился визуальный анализ индивидуальных бактериальных клонов с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, с отбором быстро созревающих вариантов, характеризующихся максимально яркой красной флуоресценцией. Примечание: Под термином «яркость», в зависимости от контекста, подразумевается одна из двух характеристик: расчетная яркость флуоресценции, получаемая как произведение квантового выхода флуоресценции и коэффициента молярной экстинкции при максимуме возбуждения флуоресценции, либо результирующая (детектируемая) яркость флуоресцентного сигнала в живой системе, которая зависит, помимо расчетной яркости флуоресцентного белка, от ряда других параметров, таких как эффективность транскрипции и трансляции гена флуоресцентного белка, стабильность мРНК, скорость и эффективность (процент) созревания хромофора в данных условиях, скорость деградации флуоресцентного белка в живых клетках. Аминокислотные замены, приводящие к улучшению характеристик, но не способные, согласно анализу трехмерной структуры eqFP611, привести к восстановлению димеризации, объединяли методом направленного мутагенеза и использовали в качестве основы для последующих раундов случайного мутагенеза. В общей сложности, было проведено семь раундов случайного мутагенеза, результатом которых стал финальный отобранный вариант, получивший название TagRFP (от английского Tag - ярлык, бирка, и Red Fluorescent Protein - красный флуоресцентный белок). Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции TagRFP приходятся на 555 нм и 584 нм, соответственно (рис. 1a). Молярный коэффициент экстинкции белка TagRFP при 556 нм составляет 100 000 M-1см-1, а квантовый выход флуоресценции равен 0.48 (расчетная яркость в 2.2 раза превышает таковую красного мономерного белка mCherry, полученного коллективом Р. Тсиена). Спектр поглощения свежевыделенного белка TagRFP характеризуется единственным максимумом при 556 нм (рис. 1b), что говорит о быстром и полном созревании хромофора, без образования альтернативных либо промежуточных, медленно дозревающих форм. a b c
...
203. Генетические детерминанты инфекционности вируса гриппа и иммуногенности противогриппозных вакцин
Романова Юлия Романовна (16.01.2012)
... Санкт-Петербург - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в Компании «AVIR Green Hills Biotechnology “, Австрия
Научный консультант:
...
204. Генетические и биологические аспекты гибридизации сельскохозяйственных и диких видов животных
Насибов Шаиг Насир оглы (11.10.2010)
... Дубровицы - 2010
Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук. Научный консультант: доктор биологических наук,
член-корреспондент РАСХН
...
205. Генетический потенциал и методы повышения мясной продуктивности овец в Поволжье
Молчанов Алексей Вячеславович (24.10.2011)
... Черкесск – 2011
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, профессор,
заслуженный деятель науки РФ
...
206. Генетическое разнообразие хантавирусов в популяциях грызунов и насекомоядных азиатской части России
Яшина Людмила Николаевна (13.02.2012)
... доктор медицинских наук, профессор Леонова Галина Николаевна
доктор медицинских наук, профессор Игнатьев Георгий Михайлович Ведущая организация
ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов
...
207. Геномная локализация и структурно-функциональные особенности генов биосинтеза флавоноидов пшеницы и ее сородичей
Хлесткина Елена Константиновна (08.08.2011)
... Новосибирск 2011 Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики растений Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Салина Е. А.
Учреждение Российской академии наук
...
208. Геномно-протеомная характеристика вариабельности Helicobacter pylori
Момыналиев Куват Темиргалиевич (10.03.2009)
... Работа выполнена в лаборатории постгеномных исследований в биологии ФГУ научно-исследовательского института Физико-Химической Медицины Минздравсоцразвития России Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Вадим Маркович Говорун Официальные оппоненты: академик РАН, доктор биологических наук, профессор Николай Александрович Колчанов член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Георгий Борисович Смирнов доктор биологических наук , профессор Николай Николаевич Соколов Ведущая организация: Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова Защита диссертации состоится «14» мая 2009 года в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при НИИ биомедицинской химии им . В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, г. Москва , Погодинская ул ., д .10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской химии им . В.Н. Ореховича РАМН Автореферат разослан «____»______________ 2009 г . Учёный секретарь диссертационного совета кандидат химических наук Елена Анатольевна Карпова ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Helicobacter pylori – грамотрицательная, микроаэрофильная бактерия, колонизирую- щая слизистую оболочку желудка и ассоциированная с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофическими гастритами, аденокарциномой или экстранодальной В-клеточной MALT-лимфомой (Mucosa Associated Lymphoid Tissue). H. pylori является одним из самых распространенных возбудителей инфекционных заболеваний. Согласно некоторым оценкам, более половины населения мира инфицированы этим микроорганизмом. Инфекция H. pylori часто не имеет клинических проявлений. Только у определенной части инфицированных (10–15%) с течением времени появляются клинически значимые симптомы болезни: развивается хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка. В 2005 г. первооткрыватели бактерии, Робин Уоррен (Robin Warren) и Барри Маршалл (Barry Marshall), были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине «за открытие бактерии Helicobacter pylori и ее роли в развитии гастрита и язвы желудка» (Marshall, Warren, 1984; Warren, 1983; Marshall, 1996).
...
209. Географические закономерности зоны оптимальных гидролого-климатических условий для аграрного природопользования (на примере Западной Сибири)
Мезенцева Ольга Варфоломеевна (19.07.2010)
... доктора географических наук
Томск, 2010 Работа выполнена на кафедре физической географии в Омском государствен- ном педагогическом университете Научный консультант: Доктор географических наук,
профессор
...
210. География сельских поселений Центрального Черноземья (эволюция, морфология, структура селитебных территорий)
Панков Сергей Викторович (08.08.2011)
... доктора географических наук
Воронеж 2011
Работа выполнена в Воронежском государственном университете Научный консультант: доктор географических наук, профессор
...
211. Геодинамика золоторудных районов юга Восточной Сибири
Корольков Алексей Тихонович (13.12.2010)
... доктора геолого-минералогических наук
Иркутск – 2011
Работа выполнена на кафедре геологии и геофизики Иркутского государствен- ного университета и на кафедре геологии и геохимии полезных ископаемых Нацио- нального исследовательского Иркутского государственного технического универси- тета (г. Иркутск) Научный консультант: доктор геолого-минералогических наук, профессор,
...
212. Геоинформационные модели и методы интегральной оценки природно-техногенной опасности территориальных систем»
Марченко Павел Евгеньевич (19.07.2010)
... Санкт-Петербург – 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук
Институте информатики и проблем регионального управления
...
213. Геолого-тектонические условия нефтегазоносности восточной части Волго-Уральской антеклизы (территория республики Татарстан)
Гатиятуллин Накип Салахович (24.01.2011)
... доктора геолого-минералогических наук
Санкт-Петербург - 2011 г.
Работа выполнена в Татарском геологоразведочном управлении ОАО «Татнефть» Официальные оппоненты: доктор геолого-минералогических наук, Фортунатова Наталия Константиновна профессор доктор геолого-минералогических наук, Халимов Элик Мазитович профессор доктор геолого-минералогических наук, Масагутов Рим Хакимович профессор
...
214. Геометрическое моделирование линейчатого метрического пространства в инженерной геометрии и ее приложениях.
Панчук Константин Леонидович (26.01.2009)
... доктора технических наук
Омск 2009
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении выс- шего профессионального образования “Омский государственный технический университет” Министерства образования и науки Российской Федерации Научный консультант: доктор технических наук, профессор
...
215. Геометрическое моделирование технологических процессов намотки и выкладки конструкций из волокнистых композиционных материалов
Битюков Юрий Иванович (16.11.2010)
... диссертации на соискание ученой степени
доктора технических наук
Москва-2010
...
216. Геометрия вещественных подмногообразий и действий вещественных групп на комплексных областях
Кружилин Николай Георгиевич (26.01.2009)
... доктор физико-математических наук, профессор Белошапка Валерий Константинович
доктор физико-математических наук, профессор Знаменский Сергей Витальевич,
доктор физико-математических наук, профессор Ивашкович Сергей Михайлович
...
217. Геомеханика нефтяных и газовых скважин
Коваленко Юрий Федорович (11.01.2012)
... Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, профессор
Гольдштейн Роберт Вениаминович
доктор технических наук, профессор
...
218. Геомеханические основы повышения устойчивости карьерных откосов при открытой разработке месторождений в сложных горно-геологических условиях
Федорова Елена Алексеевна (11.01.2012)
... диссертации на соискание ученой степени
доктора технических наук
Новосибирск 2012
...
219. Геофизические методы определения герметичности крепления обсадных колонн глубоких скважин
Конысов Асхат Кенганович (21.04.2011)
... Автореферат
диссертации на соискание уч?ной степени
доктора технических наук
...
220. Геофизический мониторинг напряженно-деформированного состояния природных и техногенных систем
Татьков Геннадий Иванович (13.04.2009)
... геолого-минералогических наук
Иркутск 2009
Работа выполнена в Геологическом институте Сибирского отделения Российской
...
| Страницы: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 |