Doc2All.ru

Москва - 2010 Работа выполнена в лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка РАН ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор химических наук, профессор, академик РАН Богданов Алексей Алексеевич Доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна Доктор физико-математических наук Хечинашвили Николай Николаевич ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Филиал Института биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Защита состоится «___»________2010 года в____часов на заседании диссертационного Совета Д 501.001.76. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536. C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «___»__________________2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И. А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез белков на рибосоме является одним из ключевых процессов жизнедеятельности любого организма, поэтому выяснение принципов структурной организации рибосомы и молекулярных механизмов трансляции является одной из самых актуальных проблем молекулярной биологии. С одной стороны, рибосома – это уникальный рибонуклеопротеид, консервативность структуры которого определяет универсальность ключевых этапов биосинтеза белка в клетках разных организмов. С другой стороны, сама уникальная и консервативная структура рибосомы в значительной степени зависит от специфических молекулярных контактов между ее компонентами. В связи с этим, в рамках проблемы биосинтеза белка, одной из наиболее приоритетных задач является выяснение роли отдельных рибосомных компонентов и их межмолекулярных контактов в формировании и функционировании рибосомы. Кроме того актуальность проблемы определяется еще тем, что ее решение имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, так как именно рибосома является мишенью для целого ряда внеклеточных агентов (например, антибиотики и токсины).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение структуры бактериального 5S рРНК-белкового комплекса и специфических взаимодействий в нем, а также выяснение роли 5S рРНК-связывающих белков в сборке функционально-активной бактериальной рибосомы. Для выполнения данной работы были поставлены следующие основные задачи:

Идентификация 5S рРНК-связывающих белков рибосомы Thermus thermophilus и

выявление их гомологии с белками из других организмов.

Определение участков связывания рибосомных белков T. thermophilus на молекуле

5S рРНК. Выявление участков белков и РНК, определяющих специфическое

взаимодействие в бактериальном 5S рРНК-белковом комплексе.

Определение пространственных структур 5S рРНК-связывающих белков T.

thermophilus и их комплексов с РНК.

функционирования ее аппарата трансляции. Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе была поставлена точка в давнем вопросе о численности бактериальных 5S рРНсвязывающихся рибосомных белков: их оказалось три, и один из них, белок семейства СТС, является особенностью бактериального аппарата трансляции. Впервые было продемонстрировано, что представители семейства СТС, такие рибосомные белки как TL5 T. thermophilus и L25 E. coli, а также основной стрессовый белок CTC B. subtilis, являются не только структурными, но и функциональными гомологами. Впервые показано, что местом специфического связывания рибосомного белка L5 на 5S рРНК является С-петля. Определенная в данной работе пространственная структура большей части 5S рРНК-белкового комплекса с высоким разрешением внесла существенный вклад в построение модели рибосомы, и является востребованной до сих пор в исследованиях детальной структурной организации бактериальной рибосомы. В работе также получены данные, которые позволили впервые оценить степень необходимости каждого из 5S рРНК-связывающих белков для сборки функционально-активной рибосомы in vivo и для выживания бактериальной клетки. Впервые показано, что белок семейства СТС, не являясь необходимым для выживания клеток E. coli, чрезвычайно важен для стабилизации структуры центрального протуберанца рибосомной 50S субчастицы.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 19 статьях в российских и международных журналах и 29 тезисах, представленных на международных и российских конференциях: “ Frontiers in translation” (Виктория, Канада, 1995), “Thermophiles-96” (Атенс, США, 1996), “Structural aspects of protein synthesis” (Таллберг, Швеция, 1997), “Extremophiles-98” (Йокогама, Япония, 1998), “Thermophiles-98” (Брест, Франция, 1998), “The ribosome. Structure, function, antibiotics and cellular interactions” (Хельсинор, Дания, 1999), “Protein synthesis” (Пущино, Россия, 2001), “Crystallization of Biological Macromolecules” (Йена, Германия, 2002), “The 8th International Engelgardt conference on molecular biology. RNA-protein interaction” (Буран, Россия, 2006), International conference in honour of Alexander Spirin “Protein biosynthesis, structure and function” (Пущино, Россия, 2007), Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2001-2009), «Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, Россия, 2009).

Личный вклад автора. Результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований (гранты: 95-04-11845, 98-04-48314, 01-04-48396, 03-04-48393, 08-04-00459), Шведской академии наук и Федерации европейского биохимического общества.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 315 страницах, состоит из введения, трех глав (обзор литературы, результаты и их обсуждение, экспериментальная часть), заключения, выводов, списка цитируемой литературы (575 ссылок) и содержит 73 рисунков и 10 таблиц.

ностей белков TL4 и TL5 T.

белков из других организмов.

белки L5 из E. coli, B.

Thermus flavus, соответственно. N-концевые участки белков TL4 и 5S рРНК-связывающих рибосомных белков L5 E. coli и B. stearothermophilus консервативны. Становилось очевидным, что белок TL4 T. thermophilus является представителем семейства рибосомных белков L5. Учитывая полученные результаты и данные об организации генов spc оперона T. thermophilus, полученные в нашей лаборатории, мы клонировали и экспрессировали гены rpl5 и rpl18 T. thermophilus в штамме-продуценте E. coli. Сравнение свойств рекомбинантного белка TthL5 и рибосомного белка TL4 T. thermophilus позволило окончательно убедиться в том, что белок TL4 является продуктом гена rpl5. Кроме того сравнение свойств рибосомного белка TL18 и рекомбинантного белка TthL18 (продукт гена rpl18 T. thermophilus) показало, что это один и тот же белок. Таким образом, учитывая все имеющиеся данные, мы могли с полной уверенностью заключить, что белки TL4 и TL18 T. thermophilus являются гомологами известных 5S рРНК-связывающихся рибосомных белков L5 и L18 E. coli, соответственно.

Ситуация с выявлением гомологов белка TL5 оказалась гораздо сложнее, чем с двумя указанными белками T. thermophilus. Нами была определена N-концевая аминокислотная последовательность (53 остатка) белка TL5 T.thermophilus (Рис. 2). Однако этот участок белка TL5 не обнаружил какой-либо достаточно выраженной гомологии с первичными структурами известных рибосомных белков. В то же время, в лаборатории Волькера Эрдманна был выявлен 5S рРНК-связывающий белок из T. flavus с практически идентичной N-концевой аминокислотной последовательностью (Рис. 2). Таким образом, становилось очевидным, что, по крайней мере, два представителя рода Thermus имеют такой 5S рРНК-связывающий белок. Используя метод ограниченного протеолиза, нами были исследованы некоторые свойства необычного рибосомного белка TL5. Было обнаружено, что при гидролизе от свободного белка отщепляется с N-конца очень нестабильный фрагмент примерно 8-9 kDa (75-80 остатков). При этом белок, лишенный указанного N-концевого участка, оказывался неспособным связываться с 5S рРНК. В то же время данный N-концевой участок белка TL5 становился недоступным для гидролиза в комплексе с 5S рРНК. Из полученных данных следовало, что N-концевой участок белка TL5 примерно в 80 аминокислотных остатков строго необходим для связывания 5S рРНК. Так как, несмотря на все полученные данные, ситуация с обнаружением гомологов белка TL5 так и не прояснилась, мы решили секвенировать ген этого белка. Используя информацию об аминокислотной последовательности некоторых участков белка, был клонирован соответствующий фрагмент ДНК T. thermophilus. Анализ нуклеотидной последовательности этого фрагмента ДНК (1000 bp) выявил наличие в нем открытой рамки считывания (ОРС), которая была фланкирована инициаторным и терминационным кодонами. Данная ОРС кодировала полипептид в 206 аминокислотных остатков (Рис. 3). N-концевой район и область 80-90 остатков этого полипептида были идентичны N-концевым участкам белка TL5 и его большого триптического фрагмента, соответственно. Таким образом, мы пришли к заключению, что выявленный нами ген в ДНК T. thermophilus кодирует рибосомный белок TL5.

Поиск гомологов белка TL5 в доступных базах данных (SWISS-PROT, PDB и PIR) не выявил выраженного сходства с известными 5S рРНК-связывающими или другими рибосомными белками. Неожиданным оказалось то, что наибольшее сходство с белком TL5 обнаружил основной стрессовый белок CTC из Bacillus subtilis. Белки TL5 и CTC имеют сходный размер (206 и 204 аминокислотных остатков, соответственно). Сравнение первичных структур этих белков продемонстрировало Рис. 3. Сравнение первичных структур рибосомных белков TL5 T. thermophilus и L25 E. coli, а также основного стрессового белка CTC B. subtilis. очевидную, хотя и не очень высокую гомологию между ними (Рис. 3). Аминокислотные последовательности этих белков оказались гомологичны по всей длине и имели 32.5% идентичных и 53.4% сходных остатков. На момент наших исследований о белке CTC было мало что известно. Было только продемонстрировано, что экспрессия гена ctc индуцируется в клетках B. subtilis в ответ на различные типы стресса (Hecker & Volker, 1990; Volker et al., 1994). О функции белка СТС в бактериальной клетке ничего не было известно.

Еще одной удивительной находкой оказалось то, что аминокислотная последовательность N-концевого участка белка СТС обнаруживала достаточно очевидную гомологию (Рис. 3) с первичной структурой рибосомного белка L25 из E. coli. Поэтому нами был проведен более тщательный сравнительный анализ первичных структур всех трех белков. Соответствующее выравнивание аминокислотных последовательностей белков TL5, СТС и L25 расставило все точки над «и» (Рис. 3). Во-первых, даже при наилучшем выравнивании первичных структур белков L25 и TL5 наблюдался довольно низкий уровень гомологии (18% идентичности; 40% сходства) между ними. Становилось понятным, почему ранее поиск гомологов не давал результатов. Во-вторых, кластерность расположения идентичных и сходных остатков во всех указанных структурах свидетельствовала о выраженной консервативности отдельных участков этих белков. В-третьих, именно N-концевой участок белка TL5, необходимый для взаимодействия с 5S рРНК, обнаруживал гомологию с белком L25. Таким образом, тщательное сравнение первичных структур рибосомных белков TL5 и L25, а также основного стрессового белка СТС, позволило сделать заключение, что, несмотря на отсутствие ярко выраженной гомологии, эти белки являются родственными. Совокупность полученных данных позволила нам сделать предварительный вывод о том, что именно N-концевой участок белка TL5 образует домен, который может играть роль белка L25 в рибосоме T. thermophilus.

Идентификация всех белков 5S рРНК-белкового комплекса T. thermophilus позволила нам провести детальное исследование процесса формирования данного РНК-белкового комплекса. В отличие от гомологов из E. coli, каждый из исследуемых нами рибосомных белков T. thermophilus был способен образовывать эквимолярный прочный комплекс с изолированной 5S рРНК, независимо или совместно. Консервативность структуры бактериальной 5S рРНК дала нам возможность использовать в работе не только гомологические, но гетерологические РНК-белковые комплексы. Кроме того комплексы 5S рРНК с белками TthL5, TL5 и TthL18 оказались очень стабильны в широком диапазоне условий эксперимента. Все это позволило нам провести исследования, результаты которых внесли существенный вклад в локализацию участков связывания бактериальных рибосомных белков на молекуле 5S рРНК, (сайты связывания для белков L5 и L18 E. coli были окончательно установлены только в 2005 году при кристаллографических исследованиях рибосомы).

Известно, что 5S рРНК из E. coli и других бактерий при ограниченном гидролизе РНКазой А образует крупные стабильные фрагменты (Рис. 5А). Ранее было продемонстрировано, что один из фрагментов 5S рРНК E. coli (Fr5S??), состоящий из двух-трех субфрагментов (1-11 и 69-120 (69-87 и 89-120) нуклеотиды), образует комплекс с белком L25 (Doutwaite et al., 1979). Другой фрагмент 5S рРНК E. coli (Fr5S?), состоящий из двух субфрагментов (15-36 и 44-65 нуклеотиды), с рибосомными белками не связывался. Используя метод ограниченного гидролиза РНК рибонуклеазой А, нами был установлен участок 5S рРНК, взаимодействующий с рибосомным белком TL5 T. thermophilus. Оказалось, что фрагмент 5S рРНК размером примерно 60 нуклеотидов (рис. 5А, Fr5S??), связывающий белок L25 E. coli, образует специфический комплекс и с рибосомным белком TL5 (рис. 5Б, дорожка 4). Далее нами был установлен минимальный фрагмент 5S рРНК, который формировал стабильный комплекс с TL5 и его РНК-связывающим доменом (TL5fr91). В уже отмеченной выше работе Доутвейта с коллегами было показано, что 5S рРНК E. coli, находясь в комплексе с белком L25, гидролизуется РНКазой А с образованием 40 нуклеотидного фрагмента (69-87 и 90-110 нуклеотиды). Мы получили аналогичный по размеру фрагмент 5S рРНК E. coli (Рис. 5Б, дорожка 5), защищаемый белком TL5 Рис. 5. Участок связывания белка TL5 T. thermophilus на 5S рРНК. А - схема вторичной структуры 5S рРНК, на которой отмечены стрелками участки доступные РНКазе А для изолированной РНК. В рамки взяты фрагменты 5S рРНК, образующие комплекс с белком TL5 (данные фрагменты были секвенированы). Б - электрофоретический анализ (12% ПААГэ, неденатурирующие условия) взаимодействия белка TL5 и его РНК-связывающего домена (TL5fr91) с полученными фрагментами 5S рРНК E. coli. 1 - 5S рРНК; 2 - 5S рРНК + TL5; 3 – фрагмент РНК (Fr5S??); 4 – Fr5S?? +TL5; 5 – фрагмент РНК (Fr5S?); 6 – Fr5S? + TL5; 7 – Fr5S? + TL5 fr91. от гидролиза РНКазой A. Этот фрагмент 5S рРНК состоял из двух цепочек, и по данным секвенирования соответствовал участку 5S рРНК G69-U87 и C91-C110 (Рис. 5А, Fr5S?). Данный фрагмент был способен формировать стабильный комплекс с белком TL5 и TL5fr91 (Рис. 5Б, дорожки 6 и 7). Сходный по характеристикам TLсвязывающий 40 нуклеотидный фрагмент (Fr5S?) 5S рРНК T. thermophilus был также получен. Из полученных данных следовало, что область взаимодействия белка TL5 (его РНК-связывающего домена) на 5S рРНК ограничивается петлей E, спиралями IV и V (Рис. 5А). Таким образом, участки связывания на молекуле 5S рРНК для белка TL5 и его гомолога, белка L25 E. coli, оказывались практически одинаковыми.

Для картирования на 5S рРНК участков связывания белков TthL5 и TthL18 на первом этапе нами также был использован метод гидролиза РНК рибонуклеазой A. Картина энзиматического гидролиза или химической модификации нуклеотидов 5S рРНК E. coli и B. stearothermophilus, изолированной или связанной с рибосомными белками, достаточно подробно описана в литературе. Однако к началу наших работ, несмотря на многочисленные данные об участках 5S рРНК, изменяющих свою доступность различным агентам в присутствии бактериальных рибосомных белков L5 и L18, конкретные сайты связывания этих белков на РНК не были установлены. Данные рибосомные белки E. coli диссоциировали от РНК в процессе гидролиза 5S рРНК (Douthwaite et al., 1982; Leontis & Moore, 1986). Можно было предположить, что взаимодействие белков L5 и L18 E. coli с 5S рРНК было недостаточно прочным для защиты собственных сайтов на молекуле РНК.

Два описанных выше стабильных фрагмента 5S рРНК, образующихся при гидролизе РНКазой А, были нами проверены на связывание исследуемых белков. Ни белок TthL18, ни белок TthL5 не были способны образовывать комплекс с этими фрагментами 5S рРНК. Такие результаты нас не очень удивили, так как совпадали с данными полученными для гомологичных белков из E. coli. Однако, в отличие от своего аналога из мезофильного организма, белок L18 T. thermophilus оказался способным защитить 5S рРНК от энзиматического гидролиза. Так, 5S рРНК , гидролизованная в комплексе с белком TthL18, не диссоциировала на фрагменты (Рис. 6А, дорожка 4) и сохраняла способность специфически связывать этот белок (Рис. 6А, дорожка 6). Однако такая РНК была неспособна связывать белок TthL5. После гидролиза 5S рРНК в присутствии обоих белков, TthL5 и TthL18, РНК не диссоциировала на фрагменты и была способна связывать не только TthL18, но и TthL5 или оба белка одновременно (Рис. 6Б, дорожка 5-8, соответственно). Таким образом, нами было установлено, что белок TthL18 способен сам по себе защищать свой участок связывания на 5S рРНК, в то время как место связывания белка TthL5 с РНК защищалось от гидролиза только в комплексе с обоими белками – TthL18 и TthL5. Сегодня, когда по кристаллографическим данным известно, что в бактериальной рибосоме белки L5 и L18 не образуют между собой прямых контактов, обнаруженный нами совместный эффект двух белков может быть интерпретирован стабилизацией этими белками определенной конформации 5S рРНК. Сравнительный анализ полученных продуктов гидролиза 5S рРНК показал, что состав субфрагментов, Рис. 6. Электрофоретический анализ взаимодействия белков TthL5 и TthL18 с интактной или обработанной РНКазой А 5S рРНК E. coli (А и Б, 10% ПААэлектрофорез, неденатурирующие условия). А: 1 – 5S рРНК; 2 – комплекс 5S рРНTthL18; 3 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w); 4 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии белка TthL18 (с последующей фенольной депротеинизацией); 5 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 3) + TthL18; 6 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 4) + TthL18; Б: 1 - 5S рРНК; 2 – комплекс 5S рРНК-TthL18; 3 – комплекс 5S рРНК-TthL5; 4 – комплекс 5S рРНК-TthL5-TthL18; 5 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии белков TthL5 и TthL18 (с последующей фенольной депротеинизацией); 6 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthL18; 7 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthL5; 8 – гидролизат 5S рРНК (аналогично 5) + TthL5 и TthL18. В: 1 – 5S рРНК; 2 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:25, w/w) в присутствии белка TthL18; 3, 4 – продукты гидролиза 5S рРНК (нуклеаза/РНК 1:500 и 1:25, w/w, соответственно) в присутствии белков TthL5 и TthL18. (12% ПААГ-электрофорез, денатурирующие условия). Справа обозначены размеры фрагментов РНК в нуклеотидных остатках. Звездочкой отмечено положение 3’-меченого фрагмента 5S рРНК. полученных при гидролизе РНК в комплексе с белком TthL18 (Рис. 6В, дорожка 2) или с белками TthL18 и TthL5 (Рис. 6В, дорожка 4) отличается от такового для РНК в свободном состоянии. Так, в случае комплекса 5S рРНК/TthL18 накапливается новый субфрагмент длиной 45 нуклеотидов (Рис. 6В, дорожка 2). В случае комплекса 5S рРНК с двумя белками появляется и накапливается субфрагмент длиной 50 нуклеотидов (Рис. 6В, дорожки 3-4). Секвенирование данных субфрагментов показало, что субфрагмент 45 нуклеотидов охватывает участок G44-U87, а субфрагмент 50 нуклеотидов – C36-U87 (схема на Рис. 7А). Таким образом, из полученных данных следовало, что белок TthL18 защищает в 5S рРНК от гидролиза район U65-C68 (спираль II и петля А), а белок TthL5, добавленный к комплексу 5S рРНК/TthL18, защищает район C36-C43 (петля С). Кроме того, во всех экспериментах обнаруживались также два одинаковых субфрагмента, которые являлись участками Рис. 7. Участки связывания белков TthL5 и TthL18 на 5S рРНК. А - схема вторичной структуры 5S рРНК, на которой отмечены участки защищаемые белками TthL5 и TthL18 от гидролиза рибонуклеазой А. В рамку взяты фрагменты 5S рРНК, синтезированные in vitro. Б - электрофоретический анализ (12% ПААГ, неденатурирующие условия) взаимодействия белков TthL5 и TthL18 с синтезированным фрагментом Fr5S?S2. 1 – (Fr5S?S2); 2 – Fr5S?S2 + TthL5; Электрофоретический анализ (6-25% ПААГ, неденатурирующие условия) взаимодействия белков TthL5 и TthL18 с синтезированным фрагментом Fr5S?. 3 – Fr5S? +TthL18; 4 – Fr5S? +TthL5; 5 – Fr5S? +TthL5+TthL18; 6 – Fr5S?. С90-U120 и A15-C35. Эти данные свидетельствуют о том, что белки TthL5 и TthL18 не защищают петлю D и часть петли A от гидролиза (схема на Рис. 7А). Таким образом, нам впервые удалось идентифицировать участки 5S рРНК, которые защищаются рибосомными белками L5 и L18 от гидролиза ферментом. Учитывая то, что белки TthL5 и TthL18 не только эффективно защищают участки C36-C43 и U65-C68, но и взаимодействуют повторно только с РНК, сохранившей указанные участки, можно было заключить – данные области 5S рРНК важны для связывания этих белков. Полученные результаты пока еще не позволяли точно и надежно идентифицировать сайты связывания белков L5 и L18 T. thermophilus на молекуле 5S рРНК. Поэтому нами были синтезированы три фрагмента 5S рРНК E. coli, входящие в ее домен ?: два коротких фрагмента, Fr5S?S1 (G16-C27/G56-C68) и Fr5S?S2 (C28-G56), а также длинный фрагмент, Fr5S? (G16-C68), охватывающий весь домен ?. Эти фрагменты были испытаны в экспериментах по связыванию исследуемых белков. Как видно на рисунке 7Б, Fr5S?S2 образует прочный комплекс с белком TthL5 (дорожка 2). То, что 5S рРНК-связывающие белки TL5 и TthL18 и некоторые другие рибосомные белки T. thermophilus не взаимодействовали с Fr5S?S2, указывало на исключительную специфичность комплекса данного фрагмента 5S рРНК и белка TthL5. Таким образом, нам впервые удалось получить минимальный фрагмент 5S рРНК, связывающий рибосомный белок L5, а также идентифицировать основной сайт (петля C) его связывания на молекуле РНК. В то же время оказалось, что фрагмент Fr5S?S1, включающий по нашим данным единственный защищаемый белком L18 участок РНК, а по литературным данным содержащий большую часть сайта связывания белка, не связывал белок TthL18. Однако больший фрагмент, Fr5S?, представляющий собой полноразмерный домен ? 5S рРНК, образовывал комплекс не только с белком TthL5, но и с белком TthL18 (Рис 7Б, дорожки 3-5). Таким образом, область взаимодействия белка L18 T. thermophilus с 5S рРНК оказывалась более протяженной, чем участок (U65-C68) защищаемый белком от гидролиза, и охватывала большую часть домена ?. Учитывая полученные данные можно было предположить, что белок L18 имеет два участка связывания на молекуле 5S рРНК.

В данной работе был проведен поиск условий кристаллизации для идентифицированных 5S рРНК-связывающих белков T. thermophilus и их комплексов с 5S рРНК или ее фрагментами из разных бактерий. Для этого были использованы 5S рРНК E.coli, T. thermophilus и B. stearothermophilus, а также ряд специфических фрагментов 5S рРНК: Fr5S??, Fr5S?, Fr5S?S2 и Fr5S? E.coli, а также Fr5S? T. thermophilus. Кроме белка TL5 для кристаллизации РНК-белковых комплексов использовался его фрагмент, TL5fr91. Для ряда объектов удалось получить кристаллы (белок TthL5, комплексы: TL5-Fr5S?? E.coli, TL5fr91-Fr5S? E.coli, TthL18-5S рРНК T. thermophilus), однако, большинство этих кристаллов отражали рентгеновские лучи с низким разрешением. Так как кристаллы комплекса TthL18-5S рРНК T. thermophilus отражали рентгеновские лучи только до 8 ?, для определения структуры белка TthL18 нами был использован метод ЯМР. Наиболее успешными в кристаллизации оказались два объекта. Комплекс TL5-Fr5S? E.coli кристаллизовался как гексагональные линзы (Рис. 8А), отражающие рентгеновские лучи с разрешением до Рис. 8. Кристаллы РНК-белковых комплексов. А – комплекс 40 нуклеотидного фрагмента 5S рРНК (Fr5S?) E. coli с белком TL5; Б – комплекс 34 нуклеотидного фрагмента 5S рРНК (Fr5S?S2) E. coli с белком TthL5. 2.3 ?. Кристаллы комплекса TthL5-Fr5S?S2 E. coli представляли собой многогранные призмы (Рис. 8Б) и отражали рентгеновские лучи до 2.5 ?. Именно эти кристаллы и были нами использованы для структурных исследований.

Определение пространственной структуры 5S рРНК-связывающих белков и их комплексов с РНК проводили в совместной работе с группами Станислава Владимировича Никонова (Институт белка, РАН) и Торлифа Харда (Королевский Технологический Институт Стокгольма, Швеция).

рибосомного белка TL5 T.

белков TL5 (голубой цвет) T.

thermophilus и L25 (красный цвет) E.

взята из работы (Lu & Steitz, 2000).

2 в TL5 значительно длиннее и заменяет спирали 2 и 3 в L25.

C-концевой домен белка TL5, охватывающий 92–176 остатки молекулы, сильно вытянут, и имеет сигарообразную (Рис. 9А). Полипептидная цепочка этого домена пять раз сложена вдоль его длины. Семь -тяжей C-концевого домена белка формируют два антипараллельных -листа ( 7, 9, 12) и ( 8, 11, 13) и один двутяжевый параллельный -лист ( 7, 10). Обширное гидрофобное ядро протянулось через весь домен. Это гидрофобное ядро вместе с сетью водородных связей стабилизирует структуру домена. Аминокислотные остатки, формирующие это ядро, консервативны во всех известных белках семейства СТС. Общая конформация концевого домена уникальна и не обнаруживалась ранее в других белках. Относительное положение доменов белка также стабилизировано гидрофобным ядром, которое протянулось через всю молекулу и вовлекает остатки, расположенные на границе двух доменов. Структура TL5 является первой структурой многодоменного белка, представителя семейства белков СТС. Сравнение аминокислотных последовательностей известных белков семейства СТС и анализ кристаллических структур выявляет, что остатки, которые формируют гидрофобное ядро, стабилизирующее структуру обоих доменов белка TL5, строго консервативны среди белков семейства СТС. Таким образом, и C-концевой домены всех белков СТС могут свернуться в структуру с топологией как у белка TL5.

рибосомного белка L5 T.

(HmaL5) (правая панель).

Структура HmaL5 (PDB code:

al., 2000). белка HmaL5 в составе рибосомы (Ban et al., 2000) (Рис. 11Б), определенными немного раньше. Различия в структуре указанных белков L5 находятся в N-концевой области и в петлях 1 - 2, 3, 5. Рис. 12. Схематичное изображение пространственной структуры фрагмента 5S рРНК. Неканонические водородные связи указаны зелеными стрелками, а стэкинг-взаимодействия – серыми пунктирными линиями.

Фрагмент 5S рРНК E. coli, структура которого была нами определена в комплексе с рибосомным белком TthL5, включает петлю C и спираль III (Рис. 12). За исключением двух выпетленных нуклеотидов (A52 и A53), спираль III образует регулярную двуспиральную структуру в А-форме, которая заканчивается триплетом C37·(U48-A34). Другой триплет (C38-G44)·C47является основанием трехгранной «пирамиды», примыкающей к спирали III. В формирование «пирамиды» вовлечены также две неканонические пары, A39·A46 и U40·A45, и три неспаренных нуклеотида (G41, C42 и C43). Таким образом, пирамидальная часть (C38-C47) данного структурного элемента 5S рРНК построена полностью нуклеотидами петли C, за исключением нуклеотидов C35, C36 и C37, два последних из них формируют триплеты (C36·C49-G33 и C37·U48-A34) в верхней части спирали III. Положение оснований в «пирамиде» стабилизировано внутримолекулярными взаимодействиями, число которых уменьшается от основания в вершине структуры. При этом большой желобок A-спирали исчезает на поверхности пирамидальной части структуры, тогда как малый желобок сохраняется и переходит в плоскую экспонированную в растворитель платформу, которая формируется сахарофосфатным остовом G41, C42, C43, A45 и кромкой их оснований. Известно, что нуклеотидная последовательность петли C 5S рРНК чрезвычайно консервативна у Бактерий, Архей и Эукариот. На сегодняшний день определены структуры 50S рибосомных субчастиц из представителей разных доменов жизни, хотя и с различным разрешением. Однако уже сейчас можно заключить, что, по крайней мере, конформация пирамидальной части петли C фактически оказывается идентичной в бактериальной и архейной 5S рРНК, что может предполагать консервативность межмолекулярных взаимодействий. Рис. 13. А – Ленточная модель пространственной структуры комплекса белка TthL5 со специфическим фрагментом 5S рРНК. Б - сравнение структур комплексов TthL5/RNA (белок/РНК – голубой/красный цвета) и HmaL5/RNA (белок/РНК – серый/зеленый цвета). Структура HmaL5/RNA (PDB code: 1JJ2) взята из работы (Ban et al., 2000).

Модель пространственной структуры комплекса рибосомного белка TthL5 с фрагментом 5S рРНК представлена на рисунке 13, а их межмолекулярные контакты в таблице 1. Со стороны 5S РНК во взаимодействии с белком TthL5 участвуют практически только нуклеотиды пирамидальной части петли C. Видно, что почти все межмолекулярные водородные связи приходятся на этот уникальный структурный элемент 5S рРНК. Единственным исключением для данного РНК-белкового комплекса является G33, который принадлежит спирали III 5S рРНК (Табл. 1, Рис. 12).

HmaL5/5S rRNA.

*нумерация соответствует таковой в 50S рибосомной субчастице H. marismortui. Взаимодействующий с РНК участок белка сформирован атомами главной цепи и боковых остатков тяжей 2, 3 и петель 2, 3. Этот район белка сильно стабилизирован внутримолекулярными взаимодействиями, в которые вовлечены остатки, строго консервативные в белках семейства L5 (Табл. 1). Граница взаимодействия TthL5/5S рРНК стабилизирована обширной сетью водородных связей. В образовании водородных связей участвуют шесть нуклеотидов 5S рРНК и десять аминокислотных остатков белка. Из них 3 нуклеотида (C43, G44 и A45) и 3 аминокислотных остатка (Q66, T93 и R95) являются строго консервативными. C42, образующий, по крайней мере, четыре межмолекулярные водородные связи (Табл. 1), своим основание участвует еще в стэкинг-взаимодействии с боковой цепью R91. Можно предположить, что C42 является одним важнейших элементов специфического взаимодействия между 5S рРНК и белком L5. На момент проведения данной работы имелась возможность сравнить только область межмолекулярного контакта в комплексе TthL5/5S рРНК и в соответствующей области рибосомной 50S субчастицы H. marismortui (Рис. 13Б). Из данного рисунка видно, что положение белков семейства L5 относительно петли C 5S рРНК почти идентично для обоих белков. Более того, оказалось, что сетка межмолекулярных водородных связей в этой области тоже консервативна (Табл. 1). Мы предположили, что молекулы РНК и белка узнают их специфические сайты посредством атомов образующих консервативную сетку РНК - белковых водородных связей. В определенных совсем недавно структурах рибосомных 50S субчастиц из разных бактерий, выделенный нами ранее интерфейс специфического взаимодействия рибосомного белка L5 с 5S рРНК, полностью подтвердился. Важность консервативных межмолекулярных водородных связей также была отмечена выше, при описании специфического комплекса TL5-5S рРНК.

Сравнение структуры комплекса TthL5/5S рРНК со структурой соответствующего комплекса H. marismortui выявляет также некоторые различия в области РНК - белковых контактов. Так, петля ?5-?4 архейного белка L5, которая практически отсутствует в бактериальном белке (Рис. 13Б), вовлечена в дополнительные взаимодействия РНК (Табл. 1), образуя половину всех РНК-белковых водородных связей и взаимодействуя в основном с двуспиральным участком фрагмента 5S рРНК. При этом межмолекулярный недоступный растворителю район в комплексе HmaL5/5S rRNA больше в два раза, чем в комплексе TthL5/5S рРНК. В отличие от бактериальных белков, у представителей семейства L5 всех таксономических групп Архей присутствует участок, соответствующий длинной петле ?5-?4 HmaL5 (Рис. 13Б). Учитывая эти данные можно предположить, что такой обширный дополнительный контакт архейного белка с 5S рРНК, является эволюционным приобретением этих организмов, необходимым для стабилизации комплекса.

структуры белка L18 T. thermophilus (TthL18).

положение в молекуле не было определено.

-листа. Гидрофобное ядро молекулы сформировано остатками ?-листа и спирали ?1. Кроме невыявляемых из-за высокой подвижности N-концевых остатков белка, наблюдается еще некоторая внутренняя подвижность в петле 3.

На момент определения нами пространственной структуры белка TthL18 имелась возможность сравнить ее только со структурой архейного гомолога из H. marismortui (Ban et al., 2000). Белок HmaL18 значительно больше, чем TthL18 (186 и 111 остатков, соответственно), а аминокислотные последовательности их соответствующих участков обнаруживают не очень высокую гомологию (27% идентичных и 43% консервативных остатков). Аналогичный достаточно низкий уровень гомологии наблюдается между другими известными рибосомными белками L18 бактерий и архей. Однако пространственные структуры глобулярного домена белков HmaL18 и TthL18 оказались чрезвычайно похожи (Рис. 15А). При наложении Рис. 15. Сравнение пространственных структур рибосомных белков L18 T. thermophilus (красный цвет) и (А) - L18 H. marismortui (фиолетовый цвет), и (Б) - S11 T. thermophilus (синий цвет). Структура белка L18 H. marismortui (PDB code: 1JJ2) взята из работы (Ban et al., 2000), а S11 T. thermophilus (PDB code: 2J00) взята из работы (Selmer et al., 2006). 48 C? атомов элементов вторичной структуры (?-спирали и ?-тяжи) HmaL18 и TthL18, r.m.s.d. отклонение равно 1.16 ?. Различия в структуре в несвязанной и РНК - связанной формах белка наблюдались в основном в петлях. Петли 2 и 3 в белке L18 H. marismortui несколько длиннее, чем в бактериальном белке и конформация этих петель в данных белках отличается (Рис. 15А). Такое изменение петли 2 архейного белка L18, по-видимому, позволяет ему формировать дополнительные контакты с 5S рРНК. N-концевой участок белка, структуру которого нам не удалось определить в TthL18, в белке HmaL18 образует ?-спираль. Сегодня появилась возможность сравнить структуры рибосомного белка TthL18 со структурами белков семейства из разных бактериальных организмов. В данном случае – это структура свободного белка из B. stearothermophilus, определенная также методом ЯМР (Turner & Moore, 2004) и кристаллические структуры белков в составе рибосомных субчастиц T. thermophilus, E. coli, D. radiodurans (Schuwirth et al., 2005; Selmer et al., 2006; Harms et al., 2008). Оказалось, что все ранее сделанные нами выводы о сходстве пространственных структур HmaL18 и TthL18, полностью верны и для других представителей семейства бактериальных рибосомных белков L18.

B. stearothermophilus и T.

thermophilus, соответственно);

2,4,6 – 5S рРНК + CTC (РНК как в образцах 1,3,5); 7 – фрагмент 23S рРНК T. thermophilus (55 нуклеотидов); 8 - фрагмент 23S рРНК + СТС; 9 – суммарная тРНК E. coli; 10 – тРНК + СТС. прочный и стехиометрический комплекс с 5S рРНК различных видов бактерий (дорожки 2, 4 и 6), но не с фрагментом 23S рРНК T. thermophilus или с тРНК E. coli (дорожки 8 и 10). Кроме того нами было показано, что белок СТС B. subtilis, как и рибосомные белки L25 E. coli или TL5 T. thermophilus, взаимодействует с фрагментом 1 5S рРНК, содержащим петлю Е, спирали I, IV и V. Эти результаты указывали на то, что как и другие уже известные белки семейства основной стрессовый белок Bsu CTC специфически связывается с 5S рРНК. Можно было предположить, что именно молекула 5S рРНК является мишенью для белка BsuCTC в клетке во время шока.

За последние десять лет стремительно выросло число расшифрованных бактериальных геномов. Сегодня их известно уже несколько сотен. Оказалось, что геном большинства известных бактерий содержит один ген, кодирующий белок данного семейства. Более того, белки семейства СТС являются особенностью бактерий, поскольку ген ctc не обнаружен в геномах известных Архей и Эукариот (Gasteiger et al., 2003). Все известные на сегодняшний день белки СТС содержат так называемый «5S рРНК-связывающий домен». Единственным исключением являлся Aquifex aeolicus, у которого, как представлено в GenBank NCBI (Deckert et al., 1998), ген ctc кодирует белок, лишенный первых 50 аминокислотных остатков 5S рРНК - связывающего домена. Нас заинтересовало, способен ли такой укороченный белок (151 аминокислотный остаток) связывать 5S рРНК. Проверка РНК-связывающих свойств данного рекомбинантного белка AaeCTC подтвердила наши сомнения – белок, лишенный половины 5S рРНК-связывающего домена, не связывался с 5S рРНК. Однако, при внимательном анализе соответствующего участка генома данного организма, мы обнаружили ошибку (пропущенный нуклеотид). В результате этой ошибки было неверно определено положение старт кодона. В действительности данный ген кодирует белок с полноразмерным 5S рРНК-связывающим доменом. Таким образом, белок СТС A. aeolicus не является исключением среди белков семейства, а все известные белки семейства СТС имеют домен соразмерный и гомологичный белку L25 E. coli. Из всех полученных данных следовало одно общее свойство для всех известных белков семейства – они должны быть способны образовывать специфический комплекс с бактериальной 5S рРНК.

ряда бактериальных таксонов.

кодирующие многодоменные (?) и однодоменные (?) белки, а также отсутствие таких генов в геноме (?). Численные значения рядом с символом указывают количество расшифрованных геномов. Символами ?, ?, ? и ?/? обозначены субдивизионы (классы) типа Proteobacteria.

Страницы: 1 2

Авторефераты, диссертации, научные работы

Публикации 06.09.2010

Другие разделы

5S рРНК-связывающие белки бактериальной рибосомы: структура, функция и эволюция